本文译自Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上发表的一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分期陆续介绍。本期介绍第三部分。
《Super-resolvingMicroscopyinNeuroscience》
荧光成像技术在我们理解神经系统中起着关键作用。各种超分辨率显微镜方法和专用荧光探针的出现使得能够以迄今为止无与伦比的分辨率直接洞察细胞亚区室中的神经元结构和蛋白质排列。
神经元的超分辨率可视化技术揭示了对细胞骨架组成、分布、运动性和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能以及神经元-胶质细胞相互作用的新认识。自身免疫性和神经退行性疾病模型中明确的分子靶点为使用新型和创新的成像方法深入研究疾病病理生理学提供了极好的起点。超分辨率显微镜在人脑样本和临床生物标志物检测中的应用仍处于起步阶段，但为神经学和神经科学的转化研究提供了新的机会。在这篇综述中，作者描述了超分辨显微镜在过去的二十年里是如何提高我们对神经元和大脑功能和功能障碍的理解的。
在这一节中，作者将介绍SRM最近获得的关于细胞骨架的组成和动力学、突触前和突触后区室中对神经传递保真度至关重要的分子组装以及塑造神经元功能的星形胶质细胞结构的调节和构建的数据。
5.1.细胞骨架
神经元的极化性质以及树突和轴突的长度需要结构化和功能性支架来支持稳定性、适应性可塑性和货物运输，这是神经元存活和信号传导所不可或缺的。因此，神经元细胞骨架的结构布局在过去几十年中吸引了神经科学家的注意，并在其他地方进行了详细综述。20世纪70年代的EM研究揭示了三种主要类型的细丝组成神经元细胞骨架：微管大小约为20?30nm，神经丝直径为10nm，肌动蛋白丝大小为5?10nm。微管是由异二聚体组装的圆柱体，异二聚体在GTP依赖性组装过程中结合α和β微管蛋白单体，导致形成定义一个微管单位的13条原丝之一。轴突微管组织成束，根据其相对于神经元胞体的位置显示不同的方向。它们极化为快速生长的正端和缓慢生长的负端。
STED显微镜揭示了快速生长的末端在钙依赖过程中锚定在肌动蛋白皮质上。在发育中的神经元中，用dSTORM测量补充活细胞成像的实验证明了神经元极性和轴突规格，表明TRIM46驱动方向一致的平行微管束的形成，而树突微管的特征是混合极性。motor-PAINT的纳米跟踪显示，稳定的乙酰化微管显示负端向外的方向，而相反的方向在动态的酪氨酸化微管中占主导地位（图7）。由于密集的重叠定位，在神经束中密集排列的微管（例如轴突起始段）的SMLM具有挑战性。这个问题可以用两种实验方法来解决：第一，设计更小的标记探针，如微管蛋白纳米体，这有助于更详细地观察神经元微管。第二，一种去聚集超分辨率方法，如ExM，可用于显示索马和树突中的微管亚群。
图7.Motor-PAINT显示微管的方向
上排：源自跟踪原代大鼠神经元中荧光标记的运动蛋白的所有定位的总和（DIV16-17）。下面一行：轨迹方向的颜色映射。比例尺=1μm。左下角：乙酰化微管倾向于负端向外取向。右下角：抗诺考达唑处理的稳定微管显示普遍的负末端向外取向。显示平均值和标准差，t检验，***p〈0.。比例尺=1μm。
神经丝是在轴突中形成大范围平行网络的杂聚物，提供轴突直径的稳定性和调节，从而提供传导速度。其组成包括低、中、高分子量神经丝、连接蛋白和外周蛋白的三联体。它们的自组装从平行异二聚体的形成开始，然后半交错组合成反平行四聚体。最后，八个四聚体横向聚集成一个单位长度的神经丝，该神经丝进一步伸长并径向压缩成最终的神经丝外观。在丝之间的界面上形成了3?5nm大小的交叉桥，这已经用EM观察到，但对它们的功能及其与神经丝的分子相互作用的理解仍然缺失。这里，ExM结合SMLM的引入或DNA-PAINT的应用可能有助于阐明密集的神经丝中的这种相互作用。神经丝动力学已经通过光转换和光激活SRM实验进行了研究，显示了端到端的退火和切断过程。
肌动蛋白最初被认为在轴质中形成斑点状膜下包被，并与一组更集中的短肌动蛋白丝结合。在原代神经元和脑切片中使用鬼笔环肽AlexaFluor进行STORM记录，揭示了轴突肌动蛋白的新组织原则。这些实验揭示了轴突中存在表现出nm稳健重复间隔的环状肌动蛋白环，并进一步表征了轴突中βII血影蛋白和钠通道具有相似尺寸的周期性条带，而树突隔室显示出更长的肌动蛋白组织。此外，尽管通过STORM成像也在树突中显示了这种模式的普遍性并且通过应用STED显微镜的另一项研究证实。另一份报告揭示，虽然树突中也存在肌动蛋白血影蛋白为基础的周期性膜骨架，但树突中这种结构的形成倾向和发育速率低于轴突。此外，本文还显示了胞体和树突部分中肌动蛋白和血影蛋白的2D多边形晶格结构，类似于红细胞中的膜骨架结构。此外，使用SiR-Actin通过STED显微镜可以在活的原代神经元中观察到这种周期性模式。最后，最近的CLEM方法结合铂复制EM研究了无顶轴突中的肌动蛋白组织（PREM）和STORM，并提供了轴突辫状肌动蛋白结构与周期性肌动蛋白超微结构相关的证据（图8）。
图8.CLEM成像结合铂复制电子显微镜和原代神经元无顶轴突的STORM成像
通过PREM（灰色）可视化的轴突辫（箭头）映射在大鼠原代神经元的超分辨肌动蛋白环（假彩色）上，比例尺=2、1、0.2μm（从左到右）。中：编织间距的定量显示与周期性肌动蛋白间距相似的尺寸。右图：在PREM记录中评估的微丝厚度，未分裂（编织）和分裂（分裂）的轴突肌动蛋白编织物以蓝色表示，树突中的单个肌动蛋白微丝以紫色表示，微管以灰色表示。给出了平均值和SEM。
βII血影蛋白的敲除导致周期性肌动蛋白环结构的破坏沿着细胞器的双向轴突运输受损。与轴突过程相比，轴突起始节段中基于肌动蛋白血影蛋白的细胞骨架的分子组织与远端轴突相似，并且更稳健，如轴突起始节段（AIS）蛋白锚蛋白-G和βIV-血影蛋白的SMLM所示。此外，βIV血影蛋白和锚蛋白G存在于AIS中，而βII血影蛋白和锚蛋白B存在于远端轴突中。SMLM显示与肌动蛋白环连接的纵向头对头βIV血影蛋白和锚蛋白的二价取向有助于建立致密的AIS超微结构，甚至对靶向肌动蛋白和微管的药物治疗具有抗性。锚蛋白-G进一步显示在神经元活性增加后聚集成亚结构域，并代表精神疾病的主要风险基因。随后的SMLM研究也阐明了α2血影蛋白与βIV-血影蛋白共同在AIS提供稳健的周期性细胞骨架组织、防止AIS组装不完全以及神经变性的重要性。一份相关报告显示αII血影蛋白丰度与有髓轴突直径成比例，并表明大直径轴突更容易发生神经退行性过程。血影蛋白II免疫染色后，通过ExM研究了βII血影蛋白沿着轴突的周期模式，随后将其连接至可膨胀聚合物并在水中膨胀。这种新方法证实了先前报道的细胞骨架内的组织原则。
遗憾的是，在ExM中，鬼笔环肽探针在扩增过程中被洗掉，但是两种策略的途径针对该问题：一方面，携带甲基丙烯酰基的鬼笔环肽的三官能形式被设计用于有效地标记对接到凝胶上;另一方面，最近的一份报告使用了荧光团偶联抗体，该抗体靶向鬼笔环肽探针上的荧光团，该探针可与凝胶连接，类似于常规免疫染色。在中枢神经系统中的几种神经元细胞类型和动物物种中也证实了肌动蛋白和附属蛋白的强大超微结构组织。在周围神经系统中（PNS），STED显微镜也显示梳理的神经纤维制备物上存在重复的细胞骨架成分。最后，SMLM显示了肌动蛋白-血影蛋白骨架的重要生物学功能：它可作为信号平台，通过组织跨膜信号蛋白，包括G蛋白偶联受体（GPCR）、细胞粘附分子（CAM）和受体酪氨酸激酶（RTK），从而实现GPCR和CAM介导的RTK信号传导，实现神经元中的信号转导。
5.2.突触前室
为了确保有效的化学神经传递，突触前结介导突触囊泡循环、神经递质填充以及在称为活性区的专门蛋白质密集纳米区室与突触前膜融合，最终释放其神经递质含量。在此，我们